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Apr 19, 2024

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 474 (2023) Citar este artigo

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A tecnologia de moagem por feixe de íons criofocados (crio-FIB) foi desenvolvida para a fabricação de crio-lamelas de espécimes nativos congelados para estudo por tomografia crioeletrônica in situ (crio-ET). No entanto, a precisão do alvo de interesse ainda é um dos principais gargalos que limitam a aplicação. Aqui, desenvolvemos um sistema de microscopia óptica e eletrônica crio-correlativa (crio-CLEM) denominado HOPE-SIM, incorporando um sistema de microscopia de fluorescência de iluminação estruturada 3D (SIM) e um estágio de alto vácuo atualizado para obter crio-FIB direcionado de forma eficiente. Com a super resolução 3D do crio-SIM, bem como nosso software crio-CLEM, 3D-View, a precisão da correlação da região de interesse pode chegar a 110 nm o suficiente para a subsequente fabricação de crio-lamelas. Utilizamos com sucesso o sistema HOPE-SIM para preparar crio-lamelas visando mitocôndrias, centrossomas de células HeLa e compartimento de montagem de herpesvírus de células BHK-21 infectadas, o que sugere a alta potência do sistema HOPE-SIM para futuro crio-ET in situ fluxos de trabalho.

Revelar ultraestruturas celulares tridimensionais (3D) é um passo importante na compreensão da vida. Nos últimos anos, a microscopia crioeletrônica (crio-EM) tem se aprimorado cada vez mais e está se tornando uma das principais técnicas biofísicas utilizadas para estudar estruturas 3D de alta resolução de complexos macromoleculares . Além disso, a tomografia crioeletrônica (crio-ET) emergiu como outra ferramenta poderosa para visualizar a organização macromolecular de paisagens celulares imperturbadas com potencial para atingir resolução quase atômica . Para visualizar a ultraestrutura subcelular em células vitrificadas por crio-ET, a moagem de feixe de íons focada sob condições criogênicas (crio-FIB) tem sido usada para preparar crio-lamelas finas a partir de células vitrificadas, permitindo muitas observações biológicas emocionantes dentro das células. A organização tridimensional das organelas celulares, como o citoesqueleto5,6,7,8,9, o retículo endoplasmático (RE)10 e o proteassoma 26S11, foi analisada com sucesso por crio-ET.

Existem várias limitações que impedem uma aplicação mais ampla da crio-TE, incluindo dificuldades na localização e identificação de características de interesse12. A microscopia crio-correlativa de luz e eletrônica (crio-CLEM)13,14,15,16,17,18 provou ser uma abordagem eficaz para superar esse problema, utilizando marcação fluorescente para navegar em direção ao alvo para o subsequente crio-FIB moagem de células vitrificadas14,15,16,17 ou imagem crio-ET de seções hidratadas congeladas12,18. Considerando que a espessura normal das células está muito além do caminho livre médio dos elétrons de 300 keV, a fabricação de células vitrificadas com uma espessura de ~ 200 nm é necessária antes da coleta de dados crio-ET. Portanto, o procedimento experimental sequencial de vitrificação, microscopia de criofluorescência (crio-FM), crio-FIB e crio-ET tornou-se um fluxo de trabalho de rotina para muitos estudos estruturais in situ específicos do local 12,19,20,21,22, 23. Este fluxo de trabalho normalmente requer um microscópio de fluorescência autônomo com um estágio criogênico para imagens de criofluorescência15,16,17,24,25, seguido por microscopia eletrônica de varredura criogênica (crio-SEM). Um alinhamento de correlação entre as imagens crio-FM e crio-SEM é gerado e usado para orientar a moagem crio-FIB12,18,21,26. Além disso, marcadores fiduciais específicos visualizados tanto pelo crio-FM quanto pelo crio-FIB, como esferas fluorescentes, são necessários para o alinhamento de correlação usando software correlativo 3D específico . Houve muitas implementações de hardware relatadas para realizar esse fluxo de trabalho, desenvolvendo microscopia criogênica de fluorescência de campo amplo ou microscopia confocal crio-Airyscan de alta resolução (CACM) .

A precisão da correlação e a taxa de sucesso entre crio-FM e crio-FIB são limitadas pela resolução do crio-FM e ainda atenuadas pelos fatores de deformação da amostra, desvitrificação e contaminação por gelo7,21. Anteriormente, desenvolvemos uma plataforma óptica exclusiva de alto vácuo para crio-CLEM (HOPE) 25, que utilizou um suporte criogênico integrado e uma câmara de vácuo específica para minimizar a contaminação por gelo e reduzir o risco de deformação e desvitrificação da amostra durante imagens crio-FM e transferência de amostra. No entanto, o uso de um microscópio de fluorescência de campo amplo com lentes objetivas de baixa abertura numérica (NA) e sem a informação da posição z dos alvos fluorescentes em nosso sistema HOPE limitou a precisão da correlação acima de um mícron, o que precisa ser melhorado para aumentar a taxa de sucesso da moagem crio-FIB específica do local.